科普小課堂|Masson三色染色總踩坑？這些FAQ幫你 “避坑通關”！

Masson三色染色總踩坑？這些FAQ幫你 “避坑通關"！

Masson三色染色的主要用途是什么？

用于區分組織中的膠原纖維（染藍色/綠色）、紅細胞/肌纖維/細胞質（染紅色）和細胞核（染深棕/黑色）。常用于評估纖維化（如肝纖維化、腎小球硬化）、腫瘤間質增生或肌肉病理研究。

經典Masson三色染色的關鍵試劑是什么，分別有什么作用？

Bounis固定液

用于固定組織形態，效果良好，可以媒染膠原組織，增加染料滲透性和對比度（可使用改良媒染液替代）。

Weigert鐵蘇木素染色液

用于核染色，含鐵離子媒染，使蘇木素與核DNA牢固結合，耐酸清洗。

麗春紅品紅染色液

用于肌纖維染色，小分子酸性染料易滲透致密程度高的肌纖維將其染成紅色。

磷鉬酸

用于分化膠原纖維的麗春紅品紅染色效果，并強化膠原纖維疏松結構，促進苯胺藍結合，分化時間決定紅藍對比度。

苯胺藍染色液

用于膠原纖維染色，大分子酸性染料易滲透致密程度低的膠原纖維將其染成藍色。

弱酸溶液

用于麗春紅品紅和苯胺藍染色后清洗切片，弱酸性溶液可以起到固色作用，穩定紅色與藍色著色。

G1346-改良Masson染色試劑盒相比于G1340-Masson染色試劑盒的優勢是什么？

G1346優勢主要體現在2個方面：

1. 使用天青石藍蘇木素，無需現用現配鐵蘇木素，操作更簡單；

2. 使用環保無毒的媒染劑用于膠原纖維預處理，色彩更清晰鮮艷、纖維更加清晰、不易出現過染等。

兩款試劑盒均適用于組織的石蠟切片、冰凍切片等染色，且染色穩定、色彩鮮艷。

G1340染色-小鼠腎石蠟切片

G1346染色-小鼠腎石蠟切片

G1340-Masson三色染色結束后整張片子整體顏色偏紫紅、膠原纖維藍色著色不清晰是什么原因？如何進行調整？

原因分析1:

苯胺藍染色時間短、染色效果不夠，從而使紅色成為主導色，導致切片整體偏紫紅。

調整意見:

可以嘗試增加苯胺藍染色時間，每次以30s為遞增單位或者在磷鉬酸分化后，快速用蒸餾水清洗3-5s，然后再進行苯胺藍染色。

原因分析2:

磷鉬酸分化不足導致膠原纖維有殘留麗春紅品紅著色，苯胺藍后續染色效果不佳。

調整意見:

可以嘗試增加磷鉬酸分化時間至2-3min。

G1340-Masson三色染色結束后整張片子整體顏色偏藍紫、肌纖維紅色著色不鮮艷是什么原因？如何進行調整？

原因分析1:

苯胺藍染色時間長、染色效果過度，從而使藍色成為主導色，導致切片整體偏藍。

調整意見:

可以嘗試增加麗春紅品紅染色時間，同時減少苯胺藍染色時間（先以2min為基礎進行染色，然后根據結果再調整時間）。

原因分析2:

磷鉬酸分化過度導致肌纖維紅色著色不牢，再進行苯胺藍染色后被遮蓋。

調整意見:

可以嘗試減少磷鉬酸分化時間至0.5-1min。

染色結果不能及時封片應該如何保存？封片后可以保存多久？

如染色后不能及時封片，可以先將切片置于弱酸溶液里暫時保存幾個小時（若觀察到有明顯顏色溶出現象，需要及時拿出，然后梯度乙醇快速脫水封片），中性樹膠封片后的樣本一般可以保存至少6個月，但還是建議等樹膠凝結干燥之后及時拍照留存結果，防止長期保存過程中蓋玻片污染從而影響后續觀察。

該試劑盒用于冰凍切片染色時有哪些注意事項？

1. 由于冰凍切片較比石蠟切片易上色，而且不同組織的染色時間也不同，所以需要調整各步驟的染色/處理時間，對于易上色組織樣本，可將每一步的染色時間減半來染色；

2. 在苯胺藍染色這一步，需要用弱酸溶液將苯胺藍稀釋3-5倍后使用，否則容易出現過染現象；

3. 染色和清洗切片時，操作手法盡量輕柔小心，以免組織脫落或翻起；

4. 冰凍切片較石蠟切片組織厚好幾倍，最終呈現的染色結果鮮艷度可能會遜色于石蠟切片為正常現象。

染色背景有雜質或污濁是什么原因？

1. 脫蠟不充分，可能存在殘留蠟質，建議增加烤片時間或更換新的二甲-苯試劑或環保組織透明脫蠟液；

2. 試劑存在沉淀，如果不確定是否是沉淀，可以吸取50μL液體置于干凈的載玻片上，于顯微鏡下觀察是否有大量懸浮顆粒或不溶性物質，如果是沉淀，但不多，可以使用濾紙或針頭濾器過濾除雜后再使用。

石蠟切片染色封片放置幾天后出現褪色或顏色明顯變淺情況是為什么？如何避免這種現象？

可能由于封片前無水乙醇脫水和二甲-苯透明步驟使用的試劑由于多次使用摻入了一定量的水分，導致紅色或藍色著色被溶解，建議更換新的乙醇和二甲-苯進行處理或者苯胺藍染色后弱酸清洗這一步驟，及時甩干水分，直接晾干后再用中性樹膠封片，不進行脫水透明。

同一個組織的相鄰切片同時染色后出現顏色不一情況怎么辦？

由于Masson三色染色步驟繁多，如果是采取滴染方式，存在這種情況屬于正常現象，由于人為操作誤差，在依次處理切片時會有一些細微時間差異導致著色程度有所偏頗。可以通過減少一次性染色處理的切片數量或者采取浸染（缸染或小型直立切片孵育盒）的方式進行染色，盡量確保每一步處理的時間保持一致從而減少批間差異。浸染的試劑如麗春紅品紅染液和苯胺藍染液可以回收2-3次使用，但不推薦反復使用。