DNA產(chǎn)物純化試劑盒簡介

DNA產(chǎn)物純化試劑盒簡介：
對于TA克隆、酶切或者直接測序等試驗來說，純化PCR產(chǎn)物或酶切
產(chǎn)物是非常必要的。以TA克隆為例，其成功率跟目的片段的純度高
低具有重要關(guān)系。雖然未經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物也可以跟載體連接，
但會增加篩選陽性克隆的難度，因為PCR產(chǎn)物中的dNTP和引物等
可能也會跟載體連接。在進行連接試驗時，這些非特異性的產(chǎn)物會
跟特異性產(chǎn)物相互競爭，從而導(dǎo)致連接效率下降。
DNA片段純化回收原理
在獲得DNA片段后，一般采用吸附材料的方法去除雜質(zhì)和純化
DNA片段。目前大多數(shù)生物公司都采用硅基質(zhì)吸附材料，可特異
性吸附核酸，有效去除體系中的蛋白、鹽類和有機物質(zhì)。
DNA片段純化回收的種類
根據(jù)DNA片段在待回收體系中是否為單一條帶，可將DNA片段純
化回收分為兩大類：直接純化和切膠純化。Solarbio公司針對這兩
種純化方法開發(fā)出DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA純
化回收試劑盒，可以滿足不同的試驗要求。
直接純化
適用于有單一DNA片段或溶液中所有DNA片段都需要回收。對于一些
下游試驗如測序、SNP分析等，需要從PCR或酶切產(chǎn)物中去除鹽離子、
dNTP、蛋白、引物等雜質(zhì)，因為這些成分會抑制后續(xù)試驗的酶活性。
切膠純化
適用于選擇性回收溶液中多種DNA片段中的一種。對于后續(xù)試驗，采用
切膠純化是有效的方法。通過瓊脂糖凝膠電泳可以分開特異性條帶和
非特異性條帶，在紫外光下快速有效地切下目的片段所在位置的凝膠，
然后通過進一步的純化就可以得到目的片段。對于要求較高的后續(xù)試
驗，建議采用切膠純化的方法，這樣得到的片段純度比直接純化要高一些。
DNA片段回收純化的一般流程：
一、反應(yīng)液收集
PCR反應(yīng)液
1、如要進行后續(xù)TA克隆，請選用能在擴增產(chǎn)物末端加A尾的聚合
酶，如Taq酶或Hotstart Taq酶。
2、如對擴增序列保真度要求高，請選用具高保真擴增能力的聚合
酶，如Pfu酶。
3、由Pfu酶擴增得到的PCR產(chǎn)物不帶A尾，如要進行基因克隆，可
選用加A反應(yīng)液對其添加A尾，從而保證克隆效率。
酶切反應(yīng)液
1、酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成
分會干擾酶切反應(yīng)。
2、雙酶切反應(yīng)條件選擇可從兩種酶的反應(yīng)溫度以及反應(yīng)buffer
來決定：從反應(yīng)溫度考慮，應(yīng)按照先高溫后低溫的順序進
行；從反應(yīng)buffer考慮，應(yīng)按照先低鹽后高鹽的順序進行。
二、電泳檢測
PCR或酶切反應(yīng)結(jié)束，一般通過凝膠電泳檢測擴增或酶切結(jié)果。凝
膠電泳分為瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種，其中聚丙烯酰胺凝
膠電泳普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸，瓊脂糖凝膠在分離
同工酶及其亞型、大分子核酸等應(yīng)用較廣。這兩種疑膠電泳是分
離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。
瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、常用的分離純化和鑒
定核酸的方法。根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂
糖和低熔點瓊脂糖。低熔點瓊脂糖的熔點為62-65℃，溶解后在
37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收、質(zhì)粒
與外源性DNA的快速連接等。
DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率與瓊脂糖濃度、DNA分子量及構(gòu)
象、電泳緩沖液、電場強度等因素有關(guān)。一般來說，DNA片段越大或瓊
脂糖濃度越大，其遷移速率越小；而電場強度越高，其遷移速率越大。
分子生物學(xué)實驗中常用的電泳緩沖液主要有三種：TAE、TBE和
TPE。TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE會導(dǎo)致DNA
片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀。TAE緩沖容量低，
但價格較便宜，TBE緩沖液含有的EDTA可螯合二價陽離子，可抑制
DNase活性，防止PCR擴增產(chǎn)物降解。
聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體在催化劑TEMED和過硫酸銨
的作用下聚合形成長鏈，并在交聯(lián)劑N,N’-亞甲雙丙烯酰胺參與
下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。
聚丙烯酰胺凝膠電泳特別適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1kb
的DNA片段和DNA序列分析，長度僅相差0.2％（即500bp相差1bp）
的核苷酸分子即能分離。
聚丙烯酰胺分辨率較瓊脂糖凝膠分辨率高，按性質(zhì)可分為變性與非
變性兩種。前者主要用于單鏈DNA的分離及純化，后者則主要用于
雙鏈DNA的分離及純化。
核酸電泳指示劑
核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭及二甲苯青兩種。溴酚蘭在堿性液
體中呈紫蘭色，在0.6％、1％、1.4％和2％瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚
蘭的遷移率分別與1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的雙鏈線性DNA片段
大致相同。二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1％和1.4％瓊脂糖中電
泳時，其遷移速率分別與2kb和1.6kb的雙鏈線性DNA大致相似。指
示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的
作用有：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加
樣孔內(nèi)。②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速
度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。
核酸電泳染色劑
核酸電泳后，需經(jīng)染色才能顯現(xiàn)出帶型，常用的是溴化乙錠染色
法，其次是銀染法。1、溴化乙錠染色法：EB是一種熒光染料，EB
分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒
光。2、銀染法：銀染色液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合
物。然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒。可把核酸電泳帶染成
黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染
色。其靈敏度比EB高200倍，但銀染后，DNA不宜回收。
三、DNA片段純化
根據(jù)電泳結(jié)果，確定待回收的DNA片段在回收體系中是否為單一條
帶后，可分別選擇不同的DNA片段純化試劑盒。如果目的DNA片
段在回收體系中為特異的單一條帶，則可以選擇DNA產(chǎn)物純化回收
試劑盒；如果在回收體系中的DNA片段外還有其它非特異性DNA片
段，則需要選擇瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。